Fiche d’activité n°2 (Concevoir et maitriser des protocoles expérimentaux)
Mettre au point un protocole de digestion enzymatique
... afin de réaliser une digestion de restriction de l’ADN de 45 kb du virus bactériophage lambda par l’enzyme EcoRI.1- Déterminer la quantité d’enzyme nécessaire à la digestion totale d’un ADN viral
1-1- En reprenant les calculs de la fiche précédente, ou la répartition des nucléotides sur la séquence d’ADN est considérée comme aléatoire, combien de sites de restriction EcoR I doit on s’attendre à trouver sur l’ADN du phage lambda ?
1-1- Une unité (1 u.) d’enzyme est définie
comme la quantité capable de découper 1 µg d’ADN sur un site de restriction en 1
heure.
Quelle quantité d’enzyme utiliser pour une digestion complète d’1 µg
d’ADN de phage lambda par EcoR I en 1h?
2- Déterminer les conditions de la digestion enzymatique de restriction
2-1- Quels paramètres de l’activité enzymatique doivent être pris en considération afin d’optimiser la digestion enzymatique de l’ADN ?
2-2- On souhaite digérer 1 µg d’ADN.
La solution d’ADN est fournie à une concentration de 0.5 µg/µl.
10 unités d’enzymes sont nécessaires à la digestion d’1 µg d’ADN.
L’enzyme utilisé a une concentration initiale de 10 unités/µl (basse
concentration).
Cette digestion se fait à pH constant grace à l ’addition d’un tampon
concentré 10 fois : le volume de tampon initial utilisé doit donc correspondre à 10% du
volume total final du tube de digestion.
Dans quel ordre doit se faire le dépôt compte tenu du fait que l’enzyme doit être maintenu le plus longtemps possible à -20°C avant utilisation ?
| Dépots | Volume (µl) | Ordre de dépot |
| ADN | ||
| Enzyme | ||
| Tampon | ||
| Eau distillée | ||
| Volume total final | 20 |
| Réponses
attendues 1-1- 10 u. 1-2- en 1 h. : 1 site / 1 µg / 1 u. -> 10 sites / 1µg / 10 u. 2-1- température (bain marie), pH (tampon), concentrations en enzyme et substrat. 2-2- dans l’ordre : complément 15 µl d’eau distillée, 2 µl ADN, 2 µl tampon, 1 µl enzyme |
