Principe:Une
molécule d'ADN est découpée en fragments de différente
taille (ou fragments de restriction) par une enzyme de restriction
puis soumise à un champ électrique dans une cuve à
électrophorèse.
Les fragments migrent en fonction de leur
masse moléculaire, les plus petits étant les plus rapides.
1)
Préparation
d'une solution d'agarose coulée dans le plateau de la cuve à
électrophorèse.
2)
Préparation
de solution d'ADN
Elles ont
été préparées avant la séance de TP.
Nous utiliserons:
de l'ADN
d'un bactériophage, le phage l
, digéré ( = coupé)
par une enzyme de restriction EcoRI.
La taille
des fragments d'ADN obtenus est connue et cet ADN servira de référence
pour la recherche de la taille de fragments inconnus: c'est l'ADN
de référence ou marqueur de taille.
Le même
ADN du bactériophage l digéré
par une autre enzyme de restriction HINDIII
- de l'ADN
plasmidique non digéré P1, P2ou P3 ( un plasmide est un mini-chromosome
situé à l'intérieur d'une bactérie ).
- de l'ADN
plasmidique P1, P2 ou P3 digéré.
En le
digérant, on libère l'insert ou sonde moléculaire
qu'il contenait ( voir l'ensemble du Southern blot ).
* Dans chaque eppendorf, ajouter aux 20 ml de
solution d'ADN 6ml
de solution de charge. Celle-ci contient un colorant bleu de bromophénol
qui migre aussi rapidement que les brins les plus rapides (témoin
de la migration). Cette solution densifie aussi l'échantillon et
permet le dépôt de l'ADN au fond des puits.
3)
Dépôt de l'ADN
A l'aide d'une micropipette, déposer dans
chaque puits 12 ml
de solution d'ADN densifié. Dans l'ordre: ADN de référence,
ADN de phage digéré par HINDIII, ADN plasmidique non digéré,
ADN plasmidique digéré.
4)
Migration électrophorétique
-
faible voltage ( 40 volts) , plusieurs heures
- ou haut
voltage ( 90 volts ) durant une heure
5)
Révélation
des fragments d'ADN
Le support
et le gel sont retirés de la cuve puis placés dans un bac
contenant du colorant.
- colorer
durant 15 minutes
- décolorer
ensuite le gel par plusieurs bains successifs d'eau déminéralisée
: les fragments d'ADNsont alors bien visibles.
6)
Exploitation
des résultats
a. utilisation
de l'ADN de référence
-
repérer surl'agarose les fragments de restriction obtenus
* Grâce
à EcoRI, l'ADN du phage l
est découpé en fragments de:
21,226
kilobases kb - 7,421 kb - 5,804 kb -5,643 kb - 4,878 kb - 3,530 kb
* La technique
de coloration utilisée ne permet pas de visualiser les fragments
de petite taille.
-mesurer
la distance de migration de ces fragments
- établir
la courbe étalon Log (T ) = f ( d )
T = taille
de l'ADN en kb d = distance
de migration en mm
b. déterminer
graphiquement la taille de fragments d'ADN
-fragments
de restriction de l'ADN du bactériophage l digéré
par HINDIII
Comparer les fragments obtenus par deux enzymes de restricton différentes
digérant le même ADN et leurs sites de coupure.
Déduire le rôle d'une enzyme de restriction.
- comparaison
des tailles des sondes moléculaires insérées dans
les plasmides P1, P2 et P3.
Matériel
utilisé :
- Cuve
à électrophorèse de petite dimension ( 11 puits disponibles
) et son alimentation.
- Cuve
de grande taille ( 2 rangées de 20 puits ) et son alimentation.
- Plusieurs
micropipettes à volume variable de 5 à 50 ml
- Cônes
pour micropipettes
- Microtubes
type Eppendorf
- Différentes
solutions d'ADN :
- ADN
de phage l
digéré par EcoRI
- ADN
de phage l
digéré par HindIII ( fournisseurs: Jeulin, Sigma etc )
- ADN
plasmidique non digéré P1, P2, P3
- ADN
plasmidique digéré P1c, P2c, P3c (préparés
par Mme Ducret ).
-Tampon
tris borate éthylène diamine (Jeulin )
- Solution
de charge ( Jeulin )
- Colorant
pour électrophorèse de l'ADN (Jeulin )
- Agarose
( Jeulin )
* La
méthode utilisée permet la visualisation de l'ADN par coloration
sans utilisation du bromure d'éthydium, produit dangereux à
manipuler et de la lumièreU.V.
* Les
fragments d'ADN colorés peuvent être conservés plus
de 10 jours à l'obscurité ou même recolorés
en cas de nécessité.
* Pour
la lecture du gel, plusieurs solutions:
- utilisation
d'une caméra permettant une observation collective
-découpage
du gel pour chaque groupe d'élèves
- observation
d'images numérisées.
Résultats
:
 |
* Utilisation
d'une cuve à électrophorèse de grande dimension (
2 rangées de 20 puits utilisables)
Chaque élève apprend à déposer, à l'aide
d'une micropipette, quelques µl d'une solution colorée ( ici
du bleu de Coomassie ).
Migration
de quelques minutes pour comprendre le principe
de l'électrophorèse.
° La distance de migration est quasiment identique
dans tous les puits.
° Il faudrait utiliser plusieurs colorants
pour mettre en évidence l'influence de la taille
moléculaire sur
la distance de migration. |
| Photo I : Cuve à électrophorèse |
 |
Electrophorèse d'ADN de bactériophage
et d'ADN inconnu.
(Interprétation sur le croquis de gauche.) |
| 1) Phage l digéré
par Hind III ( fragments de 23,13-9,41-6,55 Kb).
2) Phage l digéré
par Ecor I (1,22-7,42-5,80-5,64 Kb )
3) Plasmide P2 non coupé
:difficile à interpréter. Plusieurs bandes sont visibles.
4) Plasmide P2 coupé ( plasmide
+ insert = 2,1 Kb )
5) Plasmide P3 coupé ( plasmide
+ insert = 2,5 Kb )
6) Plasmide P3 coupé : idem
que 5)
Avec plasmide P1 coupé, non
utilisé ici , l'insert de 0,84 Kb aurait migré beaucoup plus
loin.
7) Plasmide P3 non coupé
( la bande correspond au Plasmide ).
8) idem que 1)
9) idem que 2) |
Résultats d'une électrophorèse
d'ADN de Plasmides et de Phagel. |
 |
 |
| d = 26 mm
Log 21,226 = 1,32 |
d =39 mm
Log 7,421 = 0,86 |
d = 43 mm
Log 5,804 = 0,76 |
d = 45 mm
Log 5,643 = 0,74 |
Fragments de restriction
obtenus avec l'ADN du
phagel digéré
par HINDIII |
d = 25 mm
Log T= 1,35
T =22,38 au
lieu de
23,12 Kb |
d = 36 mm
Log T= 0,96
T= 9,12 au
lieu de
9,41 Kb |
d = 41mm
Log T= 0,81
T=6,45 au lieu
de 6,55 Kb |
J.L.Rouquette
Professeur SVT (Lycée Chaptal , MENDE)
Lycée Clémenceau Montpellier
