Extraction

EXTRACTION DE L'ADN

Matériel biologique : le thymus de veau
Afin de conserver l'intégrité de la structure de l'ADN, on utilise des solutions tampons et toutes les opérations se déroulent au froid, en disposant les récipients dans de la glace pilée et en sortant les réactifs au dernier moment du réfrigérateur ou du congélateur.

Comment libérer la chromatine des structures cellulaires qui la contiennent ?

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Déroulement du chromosome bactérien après éclatement de la cellule (M.E.B.)

Destruction des structures tissulaires
Emietter finement, à l'aide d'un scalpel, sur une lame de verre, 0.5 g de thymus de veau. Placer les fragments obtenus dans un tube contenant 2 ml de tampon TE. Agiter pendant 5 min. 2-

Destruction des membranes cellulaires
On utilise un détergent, le SDS. Ajouter dans le tube 0.5 ml de SDS. Achever le broyage avec l'extrémité d'un agitateur jusqu'à ce que le contenu du tube devienne visqueux. Agiter pendant 5 min.

Comment purifier sélectivement l'ADN contenu dans la chromatine ?

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Isolement des protéines auxquelles l'ADN est associé
Ajouter 2 ml d'un mélange chloroforme + alcool isoamylique. Agiter 5 min. puis centifuger 15 ' à 3000 tr/min. Récupérer le surnageant à la pipette dans un tube propre.

Précipitation sélective de l'ADN
Verser doucement 2.5 ml d'un mélange 5V éthanol froid + 2V acétate de sodium dans le tube contenant l'ADN. L'ADN précipite alors sous forme de filaments blanchâtres formant la “ méduse ”. On peut recueillir ensuite cet ADN en l'enroulant autour de l'extrémité d'une pipette fine et le mettre en solution dans 0.5 à 1 ml de tampon TE.

Les différents réactifs du protocole d’extraction de l’ADN

Détergent SDS : 10 g de sodium dodécyl sulfate dans 100 ml d’éthanol 50%
Solvant de séparation des protéines : 3 V de chloroforme + 1 V d’alcool isoamylique
Solution de précipitation de l’ADN : 5 V d’éthanol absolu ou d’iso-propanol + 2 V d’acétate de sodium 3 mole/l (40.8 g d’acétate de sodium cristallisé dans 60 ml d’eau, ajuster à pH5 avec acide acétique, compléter à 100 ml avec eau distillée)