Immunodiffusion

Diffusion et immunoprécipitation en gel

L’immunodiffusion est utilisée pour étudier les spécificités d'un Ac donné vis à vis de différents Ag (ou vice versa, d'un Ag donné vis à vis de différents Ac) : Antigène Ag et anticorps Ac solubles diffusent radialement, dans un milieu gélosé sérologiquement neutre, à partir de puits creusés dans le gel et où ont été réalisés les dépôts. Les complexes immuns qui se forment éventuellement à la rencontre de l'Ag et de l'Ac sont insolubles et précipitent sous la forme d'arcs d'immunoprécipitation.

Pour une simple découverte de la méthode on pourra se limiter, par exemple, à une étude antiBSA / BSA (Bovine Sérum Albumine ) + OvAlbumine + HSA (sérum albumine humaine).
Pour une étude plus complète des complémentarités Ag/Ac, on pourra tester de l’antisérum humain avec, par exemple, un sérum humain total, des albumines et globulines humaines ou animales (schéma ci-contre).

Déroulement de la séance

Durée : 1 h pour la préparation, 30 min pour la manipulation, 48 h pour la diffusion, 15 min pour la lecture des résultats.

A préparer avant le TP

	Couler le milieu gélosé à 60°C (qu'on pourra faire fondre au microonde) dans les boites de pétri (température de gélification 40°C) afin d'obtenir un gel d'1 à 3 mm d'épaisseur (soit environ 5 ml de gélose par boite de diamètre 50 mm). Agiter la boite pour répartir la gélose. Laisser refroidir 30 min. Conserver au frais en milieu humide. On peut aussi couler l’agarose sur des lames de verre.
	Mettre en solution dans de l'eau stérile les sérums lyophilisés (antigènes et/ou anticorps) afin d'obtenir 1 ml de réactif à des concentrations d'environ 5 à 10 g/l. Les tubes de réactifs se conservent au congélateur.
	Nettoyer les outils à l'alcool. Travailler sur une paillasse propre.

L'activité pratique des élèves

	A l'aide de l'emporte pièce, creuser un puits central et autant de puits périphériques que d’antigènes à tester (les centres des puits doivent être espacés de 5 à 8 mm). Ne pas fendre la gélose !
	Remplir, à l'aide d'une micropipette ou d'une pipette pasteur, le puits central d'immunsérum et les puits périphériques des diverses solutions antigéniques. 10 à 20 µl suffisent à remplir un puits dont la surface de dépôt doit être plane. Ni bulles, ni débordements !
	Laisser diffuser 24 à 48 h à 20-25 °C, sur une surface plane. Un papier filtre humide, placé dans le couvercle de la boite de Pétri, permettra d’éviter toute dessication pendant l’incubation.

Exemples de résultats

Les arcs d'immunoprécipitation qui auront pu se former apparaissent en blanc, observés par transparence ou sur fond noir en lumière oblique. Une coloration des zones de précipitation est possible. Une étude au rétroprojecteur est interessante.

La position des arcs par rapport aux puits dépend du rapport quantité Ag / quantité Ac (plus l'arc est proche du puits central, plus la [Ag] est élevée) et de la taille des protéines impliqueés dans la diffusion. Mais cette technique permet surtout d’étudier l’immunocompatibilité Ag/Ac et la parenté des Ag dont les arcs de précipitations peuvent être comparées. La position relative des arcs permet de comparer les mélanges antigéniques. Leur forme dépend du degré d'identité des épitopes antigéniques :


Un même anticorps (puits de droite) a reconnu 2 antigènes différents formant 2 arcs de précipitaion indépendants.	L'anticorps (puits inférieur) a précipité les antigènes présents dans les 2 puits supérieurs. La position commune et la jointure des 2 arcs révèlent une identité des antigènes. Cette identité n'est que partielle car un éperon supplémentaire s'est formé du seul côté gauche.

Informations techniques

Matériel Exemples de réactifs

boites de pétri diamètre 50 mm,

emportes pièces diamètre 4 mm (la partie renflée d’une pipette pasteur fait l’affaire),

micropipettes ou, à défaut, pipettes pasteur.

pour une étude des complémentarités immunologiques interpécifiques : sérum antialbumine bovine, albumine bovine, autres albumines (humaine, ovalbumine ...).

pour une étude des complémentarités immunologiques intrapécifiques : antisérum total humain total, Ig, gamma Ig, albumine, sérum total humain.

Composition du milieu gélosé
Agarose à 2% dans tampon phosphate 0,05 M (pH 7 à 9) + éventuellement quelques gouttes d’un antiseptique (azide de sodium, par exemple).

Coloration et conservation des gels
Laver le gel 24 h dans du liquide physiologique puis dans de l’eau distillée. Préparer un mélange méthanol 5 V + acide acétique V + eau distillée 4V. Préparer puis filtrer une solution de bleu de Coomassie à 0,05 % dans le mélange. Laisser 30 min. les gels au contact du colorant puis transpariser par des bains successifs dans le mélange. Fermer hermétiquement la boite avec du papier adhésif : elle se conservera au réfrigérateur jusqu’à déshydratation totale.