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Identification des immunoglobulines par électrophorèse
L'électrophorèse permet la séparation et
l'identification des protéines du sérum en fonction de leur taille et de leur charge
électrique globale.
On pourra utiliser du sérum animal (lapin, bœuf, cheval ...) et du sérum animal
additionné d’anticorps (afin de simuler un sérum d’un animal en phase
immunitaire active).
L’identification des protéines sériques se fait
à l’aide d’un profil électrophorétique de référence.
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La classification alpha,
béta, gamma correspond simplement à la mobilité des protéines.
Les IgG (75 % des Ig totales) sont des gammaglobulines |
Déroulement de la séance
 | Durée : dépôt 10 min., éléctrophorèse 50 min.,
révélation et lecture des résultats 20 min.
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| A préparer avant le TP
 | Les bandes d'électrophorèse, conservées dans du méthanol, sont
placées dans un bain de tampon tris véronal.
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| Disposer dans différents récipients le tampon, le colorant, 4 bains
d'acide acétique, un bain de méthanol, le bain de transparisation.
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| Remplir la cuve à électrophorèse de tampon. Suivre les consignes
du constructeur pour sa mise en service
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| L'activité pratique des élèves
| La cuve à électrophorèse n'est pas alimentée ... Disposer, après
l'avoir séchée entre 2 feuilles de papier absorbant, une bande d'acétate de cellulose
sur son support dans la cuve à électrophorèse. Les extrémités de la bande plongent
dans le tampon. La face absorbante des bandes (surface mate) est placée vers le haut.
Eviter de poser les doigts sur la bande. Repérer anode et cathode !
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| Déposer au moyen d'une micropipette, d'une pipette pasteur ou de
l'applicateur fourni avec la cuve à électrophorèse quelques µl de sérum, côté
cathode, perpendiculairement à l'axe de la bande.
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| Couvrir la cuve à électrophorèse et brancher le générateur (voir
mode d’emploi de chaque générateur).
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| Laisser migrer 1 h.
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| Débrancher le générateur. Retirer les bandes.
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| Révéler les bandes suivant le protocole habituel :
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| Colorant 5 min (face absorbante vers le fond) / Acide acétique 2 min
x 4 / Méthanol 5 min / Bain de transparisation 1 min
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| Observer les résultats en plaçant la bande d'électrophorèse sur
une plaque de verre.
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Informations techniques
| Matériel |
Réactifs |
cuve à électrophorèse pour sérologie , générateur de
tension
micropipette ou applicateur (généralement livré avec la cuve)
récipients, à la taille des bandes d'électrophorèse utilisées, pour les différents
bains.
Consommables :
bandes d'acétate de cellulose, papier absorbant |
sérum animal,
tampon tris véronal,
colorant (rouge ponceau),
solution de transparisation,
acide acétique.
Le tampon et le colorant sont récupérables. |
La préparation des solutions
1 l de tampon : Diéthylmalnylurée 0,5 g / Acétate de
sodium 3,53 g / HCl N/10 42 ml / eau distillée.
1 l de solution de transparisation : Alcool méthylique 350 ml / Acide acétique 70
ml / Diacéthanolhydrox4 100 ml / eau 480 ml.
100ml de colorant : Amido Schwarz 0,5 g / Alcool méthylique 40 ml / Acide
acétique 10 ml / eau distillée 50 ml.
La conservation des bandes d'acétate de cellulose se fait
dans du méthanol 35 %.
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