Vidéo explicative du principe sous forme d'animations réalisé par Rémi Moreda, lycée Dr Lacroix - Narbonne

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La PCR en temps réel, principe de suivi de l'amplification grâce à des sondes Taqman. Le premier élément, c'est de connaître la zone d'ADN ou la partie d'ADN que l'on veut amplifier, un gène, une séquence. Pour pouvoir l'amplifier, il faut disposer de deux amorces spécifiques, l'amorce sens et l'amorce antisens qui vont pouvoir s'hybrider et qui bornent, qui délimitent la partie que l'on veut amplifier.

Le principe de la PCR en temps réel, c'est de suivre l'amplification en temps réel et on fait ça grâce à une sonde Taqman. La sonde est complémentaire d'un des brins dans la zone amplifiée mais dans un endroit différent des amorces. Elle est munie d'un fluorophore qui lorsqu'on 'excite émet une fluorescence. A l'état initial cette fluorescence est neutralisée par le quencher. Pour amplifier l'ADN, il nous faut une ADN polymérase ici la TAq polymérase, des nucléotides excés. Tout ça dans un liquide tamponné avec des ions Mg2+. La première étape de la PCR est la dénaturation car il faut fournir à l'ADN polymérase des simples brins d'ADN. Elle ne travaille pas sur l'ADN double brin. Il faut séparer les deux brins qui sont reliés par des lésions hydrogènes. Dans la cellule, c'est une enzyme qui fait ce travail là. Ici dans la PCR, on obtient la séparation des deux brins par dénaturation à la chaleur. On chauffe à 94°C. Les liaisons hydrogènes sont cassées et les deux brins se séparent. Mais l'ADN polymérase ne peut toujours pas travailler car elle ne sait pas démarrer la réplication sans la présence des amorces. Donc on va réduire la température à 60°C 55°C, ça dépend des amorces pour permettre aux amorces de s'hybrider les amorces hybrident mais aussi la sonde Taqman. L'ADN polymérase va pouvoir amplifier, répliquer l'ADN à partir de l'extrémité 3' des amorces et elle va comme ça associer les nucléotides complémentaires et les relier. C'est la règle d'appariement des bases. L'adénine A est complémentaire de T, la thymine. La cytosine C est complémentaire de la guanine G. La réplication se poursuit jusqu'à ce que l'ADN polymérase atteigne la sonde Taqman. Elle se retrouve bloquée au niveau de la sonde Taqman et pour pouvoir poursuivre l'élongation elle va utiliser son activité exonucléase et dégrader la sonde Taqman pour pouvoir continuer à avancer. Ceci libère le fluorophore qui va pouvoir émettre de la fluorescence lorsqu'on va mesurer cette fluorescence par excitation avec une lampe UV.

Simultanément, l'autre brin est également répliqué.

Au terme de ce cycle de PCR, la quantité d''ADN est doublée.

À chaque cycle, une mesure est réalisée par excitation UV et on mesure l'émission de fluorescence. Au-delà d'un seuil qui est prédéfini, on va détecter une fluorescence significative et déterminer le cycle seuil qui permet de savoir si la PCR est positive ou pas car il est lié à la quantité d'ADN présent au départ. Le seuil de positivité est fixé par le laboratoire. À chaque cycle de PCR, la quantité d'ADN est doublée, on choisit le nombre de cycles de PCR en fonction du seuil de positivité qui a été fixé pour le dépasser systématiquement.