Animation réalisée par Rémi Moreda du lycée Dr Lacroix de Narbonne.

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Le SYBR Green et les sondes TaqMan sont deux méthodes utilisées pour suivre l'amplification de l'ADN en PCR en temps réel.

En PCR classique, on ne détecte le produit qu'à la fin de la réaction, par exemple sur gel d'électrophorèse.

En PCR en temps réel, un signal fluorescent est mesuré à chaque cycle, ce qui permet de suivre l'amplification au fur et à mesure. On parle de PCR en temps réel ou PCR quantitative, ou qPCR.

La quantification repose sur le Ct, le cycle seuil : c'est le cycle où la fluorescence dépasse un seuil défini.

Plus la quantité de cible est élevée au départ, plus le Ct est précoce.

Comment fonctionne le SYBR Green ?

Les étapes sont les mêmes qu'en PCR classique : 
dénaturation, hybridation et élongation.

On ajoute simplement au mix un colorant, le SYBR Green I, qui se fixe sur l'ADN double brin. Lié à l'ADN double brin, il émet une forte fluorescence. Libre, il fluoresce très peu. On mesure la fluorescence à la fin de chaque élongation : elle augmente avec la quantité d'ADN amplifié.

Mais le SYBR Green se lie à tout ADN double brin, y compris les produits non spécifiques et les dimères d'amorces. C'est pourquoi on réalise, après les cycles, une courbe de fusion. On chauffe progressivement l'ADN amplifié. À sa température de fusion, la Tm, les deux brins se séparent, le SYBR Green est libéré et la fluorescence chute.

Un pic unique à la Tm attendue indique un produit spécifique. Si deux cibles ont des Tm suffisamment éloignées, de quelques degrés, la courbe de fusion permet aussi de les
distinguer. Mais comme le SYBR ne donne qu'une seule couleur, on ne peut pas les quantifier séparément.

Le SYBR Green est peu coûteux, car c'est le même réactif quelle que soit la cible, contrairement aux sondes TaqMan qui doivent être conçues pour chaque cible.

Comment fonctionne la sonde TaqMan ? C'est un oligonucléotide spécifique de la cible, qui porte un fluorochrome rapporteur en 5' et un extincteur, ou quencher, en 3'. Tant que la sonde est intacte, le quencher absorbe l'énergie du rapporteur et aucune fluorescence n'est émise. Pendant l'hybridation, la sonde se fixe uniquement sur la séquence cible, entre les deux amorces.

Lors de l'élongation, la Taq polymérase rencontre la sonde et la dégrade grâce à son activité exonucléase 5'→3'.

Le rapporteur, séparé du quencher, émet alors une fluorescence mesurable, qui s'accumule à chaque cycle. La spécificité est donc très élevée, puisqu'il faut que les deux amorces et la sonde reconnaissent la cible.

En utilisant des rapporteurs de couleurs différentes, on peut détecter plusieurs cibles dans le même tube, selon le nombre de canaux du thermocycleur, en général 4 à 6.

C'est le principe des PCR multiplexes utilisées en diagnostic.